RNA-seq即轉錄組測序技術，就是把mRNA，smallRNA，and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量測序技術把它們的序列測出來。反映出它們的表達水平。

     RNA-seq是一種集合實驗方法和計算機手段的一種技術，它可以確定生物樣本中RNA序列的特征性和豐度，也就是說，存在于每條單鏈RNA分子中的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶核糖核酸殘基的組成順序，可以通過RNA測序被識別出來。RNA-seq中的實驗方法涉及從細胞、組織或整個動物樣本中分離RNA、不同RNA文庫的構建、對文庫進行化學法測序以及隨后的生物信息學數據分析。同早期的技術方法相比，例如微陣列，一+個關鍵區別在于，當前RNA-seq平臺驚人的高通量性和高的靈敏度，使得我們能夠發現新的轉錄本、基因調控模型和更多非編碼小RNA。

    轉錄組是某個物種或者特定細胞類型產生的所有轉錄本的集合。轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程以及疾病發生過程中的分子機理，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。基于Illumina高通量測序平臺的轉錄組測序技術使能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，在分析轉錄本的結構和表達水平的同時，還能發現未知轉錄本和稀有轉錄本，地識別可變剪切位點以及cSNP（編碼序列單核苷酸多態性），提供全面的轉錄組信息。相對于傳統的芯片雜交平臺，轉錄組測序無需預先針對已知序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供更的數字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具。

    樣品提取總RNA后，對于真核生物，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，對于原核生物，用試劑盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成cDNA鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二鏈，經過試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫經末端修復、加堿基A，加測序接頭，再經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeq2000進行測序。

RNA測序流程包括：

    樣本制備、建庫：總RNA ---> polyA富集mRNA ---> 打斷 ---> 隨機引物反轉錄成cDNA ---> 末端修復、加A、加接頭

一、RNA樣本采集保存

1、血液RNA保存

    PAXgene® Blood RNA Tube采血管用于采血時細胞內RNA的快速穩定。內含保護劑采集后可以快速穩定細胞內RNA。室溫穩定3天，4℃穩定5天。

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     RNAgard Blood Tubes采血管用于血液RNA和DNA的采集、保存和純化。管內預裝保護劑能快速滲透細胞膜裂解細胞，同時穩定RNA和DNA免于降解。室溫能保存核酸達14天，4℃能保存1月。

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血漿游離RNA保存

    CELL-FREE RNA BCT® 采血管用于血漿游離RNA的采集、保存和運送。含有保護劑穩定血漿游離RNA，并能防止血液中其他背景RNA的釋放。室溫下游離RNA能穩定7天

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2、組織RNA保存

    RNALater穩定液是一種無毒的水溶性組織保存試劑，能夠快速滲入組織內部，穩定并保護細胞RNA。在37°C、25°C和4°C下 RNA 分別可保持穩定1天、1周和1個月，-20°C下可長期穩定保存。

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二、RNA提取方法-使用試劑盒方法

    富集mRNA，除去rRNA等RNA:依據為-在測mRNA過程中，首先要去除rRNA。以人為例，在抽提的總RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的則是lncRNA、microRNA、siRNA等。rRNA整個人類當中是非常保守的，在各個組織器官中也是非常穩定的，因此這些測序結果對我們的研究是沒有用處的。mRNA則是RNA中比較重要的部分。

    具體：以人的為例：總RNA跟帶有Poly(T)探針的磁珠結合-洗脫結合的mRNA-用Mg離子溶液打碎mRNA-隨機引物反轉條鏈的cDNA，之后再合成第二條cDNA,獲得雙鏈cDNA-對雙鏈cDNA末端修復，加A加接頭-片段選擇，PCR擴增、純化（如果樣本中存在污染物，則需要結合試劑盒進一步純化）。

    一般會在測序前對總RNA進行一次質檢，根據電泳質檢結果中的18S和28S（rRNA）兩個峰的高度以及峰的尖度來判斷RNA的質量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。當然，濃度以及A260/A280比值也是需要的。

總RNA提取

    TRIzol™ Reagent是一種*的即用型試劑，可用于提取高質量的總RNA或者從各種生物樣本中同時提取RNA、DNA和蛋白質。這種酚和異硫氰酸胍單相溶液，可用于提取人、動物、植物、酵母或細菌來源的細胞和組織樣本中的純RNA、DNA和蛋白質，只需一個小時即可完成。

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     GENEzol™ Reagent試劑用于高質量總RNA的提取，同時也可提取血液、白膜層、血漿、血清、培養細胞和組織等多種樣本中RNA、DNA和蛋白質。GENEzol是一種酚、三氯甲烷和異硫氰酸胍溶液，是總RNA提取經濟有效的選擇。所提取RNA可直接用于各種下游應用，如cDNA 文庫構建，克隆，逆轉錄PCR，實時PCR，核酸酶保護分析和Northern印跡雜交。

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     RNeasy Mini Kit 試劑盒可從細胞、組織或酵母中快速純化高品質RNA，硅膠膜RNeasy離心柱的結合能力達100 μg RNA。無需酚/三氯甲烷抽提，無需氯化銫梯度離心，無氯化鋰或者乙醇沉淀步驟。數分鐘內快速純化得到高品質總RNA，在各種下游應用中表現良好。

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單細胞RNA提取

    ARCTURUS PicoPure RNA 分離試劑盒用于從十個以下細胞甚至單細胞中回收高質量總RNA。

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去DNA

    Ambion Turbo DNA-free kit 除DNA試劑盒能夠*地消化DNA，并去除消化后的酶和二價陽離子。

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去rRNA

    Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Human/Mouse/Rat)試劑用于從人、小鼠、大鼠樣本中去除細胞質核糖體RNA。

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     RiboMinus Eukaryote Kit 除核糖體RNA

細菌mRNA提取

    MICROBExpress™ Kit細菌mRNA富集試劑盒通過從總RNA除去rRNA來提取細菌mRNA。

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PCR產物純化

    DNA Clean & Concentrator™-5試劑盒用于純化高達5μg DNA，DNA可來自PCR，核酸內切酶消化、DNA修飾、同位素/熒光標記等生化反應。洗脫DNA適用于PCR、微陣列、連接和測序等。該產品有助于去除DNA聚合酶、修飾酶、RNA聚合酶、連接酶、激酶、核酸酶、磷酸酶和限制性內切核酸酶，以及游離dNTP及其類似物，包括放射性標記和熒光衍生物。

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磁珠純化

細胞核分離

    Nuclei EZ Prep細胞核分離試劑盒用于從哺乳動物細胞中快速分離胞核。該試劑盒可從通用細胞類型獲得高得率細胞核。適合為染色質、基因組DNA、組蛋白和核RNA/RNP提供細胞核來源，為體外凋亡檢測、功能性研究（如細胞轉錄狀態檢查）制備細胞核。

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三、文庫構建

     建庫：去除rRNA之后獲得的mRNA進行構建文庫，先對mRNA打斷再進行反轉錄的文庫構建方法。之后反轉的cDNA再末端修復到平末端，加上ployA和接頭

四、測序試劑盒

    測序：SE測序-單端測序；PE測序-雙端測序；一般現在用的是PE測序。

UID轉錄組建庫試劑盒

• 省時同時構建8個文庫僅5小時，時間節省30％
• 省力無需第二鏈合成等步聚，操作簡便
• 省心建庫起始量低至100ng
• 測序結果與qPCR結果高度一致

 RNA鏈特異性建庫試劑盒

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• 省心建庫起始量低至100ng

關于Illuminna、Takara、Rubicon、Kapa等試劑盒詳情請聯系

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