實驗簡介：
    細胞培養技術創建于1907年，歷經一個世紀磨練與升華，現已成為自然科學領域*的研究方法之一。小伙伴們要想在如今細胞培養技術廣泛滲透的科學研究領域搞好科研，最基礎的細胞株的冷凍保存和解凍復蘇技術自然不能忽視。
    細胞凍存是將細胞放在低溫環境，減少細胞代謝，以便長期儲存的一種技術。細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，起到了細胞保種的作用。

實驗前準備： 
1.材料準備：

     生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降溫機

2.冷凍方法理論準備:

   (1)傳統方法:冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-8O℃16~18小時(或隔夜)--->液氮槽長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止胞內冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-8O℃冰箱中。
     (2）程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

實驗步驟：

細胞凍存步驟：

  1.用移液器吸走原培養基，加入適量PBS洗1-2遍;
  2.加入適量胰酶，置于培養箱中消化;
  3.待消化到位后加入適量血清或*培養基終止消化，800-1000rpm離心3-5min;
  4.配制凍存液，待細胞離心后去上清，加入凍存液重懸，調整細胞濃度為3×106~1×107 cells/mL，轉移到凍存管中;
  5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉移到液氮中保存。
  6.凍存細胞后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，
為穩妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養，觀察細胞生長情況，再繼續凍存

注意事項
  1.欲冷凍保存之細胞應在生長良好且存活率高之狀態，約為80~90%致密度。
冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

   2.細胞在液氮中可長期凍存無*，而不會影響細胞活力﹔在-70度可保存數月。注意冷凍保護劑之品質。
DMSO應為試劑級等級，無菌且無色是直接購買無菌產品，以5~10m1小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

   3.凍存細胞數量要足夠。無論再怎么小心，細胞在冷凍和復蘇過程中總會死掉一批的。所以，一開始凍存細胞的數量要足夠。一般要達到5× 10^6 /毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個不能一概而論。有些細胞，比如雜交瘤細胞，只需要1-3x 10^6 /毫升

細胞復蘇

  1.操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
   2.自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。
   3.將新鮮培養基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。
   4.取出冷凍管，立即放入3℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以7O%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。
   5.取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1:10~1:15)，混合均勻，放入培養箱培養。取0.1m1解凍細胞懸浮液作存活測試。
   6.解凍后是否立即去除冷凍保護劑，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。
   惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10m1培養基之離心管內，離心 1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入培養箱培養。

注意事項
  1.復蘇速度越快越好。從液氮罐里取出來之后，迅速放在37°C水浴中，搖晃令其盡快融化。

  2.解凍后的細胞要用和以前一樣的培養液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的，并且已經熟悉了的生長環境。突然使用不一樣的培養液和血清，會造成細胞生長不良，甚至死亡。

關于產品
CryoStor®是Biolife公司特別優化的細胞凍存液，在極低溫度 (-70ºC to -196ºC)下準備和保存細胞。預混DMSO，為細胞和組織的冷凍、儲存和解凍過程提供安全的保護環境。CryoStor®通過調控凍存過程的分子生物學反應，無血清、蛋白或具有高細胞毒性的試劑，就能增強細胞活力和功能。

貨號                產品描述                      規格
210210 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 1000mL/袋
210202 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 100mL/袋
210102 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 100mL/瓶
210374 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 16mL/瓶
210373 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液  10mL/瓶
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